Redaktuar nga Peter Sarnow, Shkolla e Mjekësisë e Universitetit Stanford, Universiteti Stanford, Kaliforni, miratuar më 25 dhjetor 2020 (shqyrtuar më 25 tetor 2020)
Ne raportojmë ndërveprimin midis nënnjësive në replikimin e komplekseve të transkriptimit të koronaviruseve, të cilat janë thelbësore për riprodhimin dhe ruajtjen e evolucionit.Ne siguruam prova që domeni NiRAN i lidhur me nsp12 ka aktivitet të transferazës nukleozid monofosfat (NMP) në trans, dhe identifikuam nsp9 (një proteinë lidhëse ARN) si objektivin e saj.NiRAN katalizon lidhjen kovalente të pjesës NMP në terminalin amino të konservuar nsp9 në një reaksion që mbështetet në jonet Mn2+ dhe mbetjet ngjitur të Asn-it të konservuara.U zbulua se aktiviteti NiRAN dhe nsp9 NMPylation janë thelbësore për riprodhimin e koronavirusit.Të dhënat na lejojnë të lidhim këtë aktivitet të shënuesit të enzimës së virusit të vendosur me vëzhgimet e mëparshme në hipotezën se fillimi i sintezës së ARN-së në një klasë të viruseve ARN është funksionalisht dhe evolucionarisht i qëndrueshëm.
ARN polimeraza e varur nga ARN (RdRps) e Nidovirales (Coronaviridae, Arterioviridae dhe 12 familje të tjera) është e lidhur me domenin amino-terminal (N-terminal) në proteinën jo-strukturore (nsp) të çliruar nga poliproteina, e quajtur NiRAN 1ab është i përbërë nga proteaza kryesore virale (Mpro).Më parë, u raportua aktiviteti i vetë virusit arterial NiRAN-RdRp nsp GMPylation/UMPylation, dhe u sugjerua të gjenerohej një kalim për transferimin e monofosfatit nukleozid (NMP) te virusi (aktualisht i panjohur) dhe/ose gjërat e biopolimerizimit të qelizave.Këtu, ne tregojmë se koronavirusi (Human Coronavirus [HCoV]-229E dhe Sindroma e Rënda Akute Respiratore Coronavirus 2) nsp12 (NiRAN-RdRp) ka aktivitet NMPilimi të varur nga Mn2+, i cili rrjedh nga nsp9 përmes formimit të nsp9 të ndërmjetësuar nga Mpro NSPS-ja anësore N-terminale lëshohet në mënyrë proteolitike, fosforamidati lidhet me aminën primare (N3825) në terminalin N të nsp9.Trifosfati uridin është nukleotidi i preferuar në këtë reaksion, por adenozinatrifosfati, guanozinatrifosfati dhe citidina trifosfati janë gjithashtu bashkësubstrate të përshtatshme.Studimet e mutacioneve duke përdorur proteinat rekombinante të koronavirusit nsp9 dhe nsp12 dhe mutantët HCoV-229E të modifikuar gjenetikisht përcaktuan mbetjet e nevojshme për nsp9 NMPilimin e ndërmjetësuar nga NiRAN dhe replikimin e virusit në kulturën e qelizave.Të dhënat konfirmuan parashikimin e mbetjeve të sitit aktiv të NiRAN dhe përcaktuan rolin e rëndësishëm të mbetjeve nsp9 N3826 në nsp9 NMPilimin dhe replikimin e virusit in vitro.Kjo mbetje është pjesë e sekuencës së konservuar të trepeptideve N-terminale NNE dhe rezultoi të jetë e vetmja mbetje invariante e nsp9 dhe homologëve të saj në familjen e koronavirusit.Ky studim ofron një bazë solide për studimin funksional të aktivitetit të NMPilimit të viruseve të tjerë të mbivendosur dhe propozon objektiva të mundshëm për zhvillimin e barnave antivirale.
Virusi ARN me fije pozitive Nidovirales infekton një shumëllojshmëri vertebroresh dhe jovertebroresh (1, 2).Urdhri aktualisht përfshin 14 familje (3), nga të cilat familja e Coronavirus është studiuar gjerësisht në 20 vitet e fundit.Në atë kohë, tre koronaviruse zoonotike dolën nga bujtësit e kafshëve dhe shkaktuan shpërthime në shkallë të gjerë të infeksioneve të rënda të frymëmarrjes tek njerëzit.Përfshirë pandemitë e vazhdueshme të shkaktuara nga sëmundje të rënda infektive akute.Sindroma e frymëmarrjes Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) (4ââ7).Nidoviruset ndajnë një organizim të përbashkët të gjenomit dhe nën-njësia e kompleksit të riprodhimit-transkriptimit të lidhur me membranën (RTC) është e koduar në dy të tretat e terminalit 5-?² dhe në nën-njësinë strukturore kryesore të grimcës së virusit, si dhe në disa aksesorë. .Proteina, e koduar në të tretën fundore 3??² të gjenomit (1).Me përjashtim të një familjeje virusesh planare (Monoviridae) (8), të gjithë viruset e mbivendosur kodojnë nën-njësi RTC në dy korniza të mëdha të hapura leximi (ORF) ORF1a dhe ORF1b, të cilat përkthehen nga ARN gjenomike e.ORF1a kodon poliproteinën (pp) 1a, dhe ORF1a dhe ORF1b kodojnë së bashku pp1ab.Me pjesëmarrjen e përgjithshme të proteazës kryesore (Mpro) të koduar nga ORF1a, të dyja pp1a dhe pp1ab përpunohen në mënyrë proteolitike në një sërë proteinash jo strukturore (nsps), të njohura gjithashtu si 3CLpro, sepse ka homologji me 3Cpro të pikornavirusit ( 9).Këto nsps mendohet se janë mbledhur në një RTC të madhe dinamike, katalizojnë sintezën e ARN gjenomike (replikimin) dhe një grup ARN nëngjenomike (transkriptim) dhe përdoren për të koordinuar shprehjen e ORF që ndodhet në rrjedhën e poshtme të ORF1b (10?? ?12).
Bërthama RTC përfshin ARN polimerazën e varur nga ARN (RdRp) (13), helikazën e superfamiljes 1 (HEL1) (14, 15) dhe disa enzima përpunuese të ARN-së, të cilat janë të koduara kryesisht në ORF1b dhe në familjen e koronavirusit Ai përmban nsp12-nsp16 dhe nsp9-nsp12 në familjen Arterioviridae (shih referencën 10ââ 12).RdRp dhe HEL1 përfaqësojnë dy (një të pestën) domene të konservuara të virusit të folesë së shpendëve dhe kanë homologji midis viruseve të tjera ARN.Replikaza thelbësore besohet se ndihmohet nga nënnjësi të tjera, duke përfshirë disa nsps të vogla të lëshuara nga rajoni karboksi-terminal (C-terminal) i pp1a, në rrjedhën e poshtme të Mpro (koronavirus nsp5 dhe virusi arterial nsp4, përkatësisht).Ata kanë mbrojtje të kufizuar specifike për familjen dhe aktivitete të ndryshme (shqyrtuar në referencën 10ââ12).
Relativisht kohët e fundit, një domen me karakteristika unike të motivit të sekuencës u gjet në terminalin amino (N-terminus) ngjitur me RdRp në të gjithë viruset e mbivendosur, por asnjë virus tjetër ARN (16).Bazuar në vendndodhjen e tij dhe aktivitetin e transferazës nukleotide (nukleozid monofosfat [NMP] transferazë), ky domen quhet NiRAN (transferaza nukleotide e lidhur me Nestvirus RdRp).Kombinimi me domen të dyfishtë i NiRAN-RdRp përbën nsp12 në familjen Coronaviridae dhe nsp9 në familjen Arterioviridae, dhe në nestoviridae të tjera, NiRAN-RdRp pritet të çlirohet si një nsp i pavarur nga poliproteina virale.Në koronavirus, domeni NiRAN përmban ??1/450 mbetje dhe është i lidhur me domenin C-terminal RdRp përmes rajonit lidhës (16?19).Në Virusin e Arteritit të Kuajve (EAV) (Arteriviridae), nsp9 rekombinante tregon aktivitetet e UMPilimit (vetë) të varur nga joni Mn2+ dhe GMPilimit, të cilat varen nga tre baza të sekuencave të ruajtura në nestovirus, AN, BN dhe CN Mbetjet në sekuencë.Ku N qëndron për NiRAN) (16).Krahimi N-terminal i këtyre motiveve është një motiv më pak konservator preAN.Disa nga këto mbetje ruhen gjithashtu në protein kinazat e lidhura larg, ku janë treguar të përfshihen në lidhjen dhe aktivitetin katalitik të trifosfatit nukleozid (NTP) (20, 21).Në përputhje me këtë vëzhgim, disa mbetje kyçe të vendndodhjes aktive në pseudokinazën SelO nga Pseudomonas syringae mund të grumbullohen me superkompleksin SARS-CoV-2 nsp7/8/12/13 të publikuar së fundmi.Mbetjet e konservuara të Coronavirus NiRAN të mbivendosura në mikrostrukturën elektronike.Proteina rekombinante (17).Spekulohet se U/GMPilimi i dokumentuar (vetë) do të prodhojë një gjendje kalimtare për të transferuar NMP në substratin (aktualisht të panjohur) (16), dhe ngjashmëria strukturore midis NiRAN dhe protein kinazës (17, 19) është hipoteza që NiRAN modifikon proteinat e tjera.
Shumë veçori, duke përfshirë lidhjen e tij unike dhe unike sistematike me viruset e mbivendosur dhe ndarjen gjenetike nga RdRp, e bëjnë NiRAN një enzimë të arsyeshme rregullatore kyçe për viruset e mbivendosur, e cila është kritike për shfaqjen dhe identitetin e tyre.Më parë, u thirrën tre funksione të mundshme që përfshinin NiRAN për të rregulluar përkthimin ose replikimin/transkriptimin e gjenomit/nëngjenomit.Kur merren parasysh të dhënat e pakta dhe jo të plota të disponueshme në atë kohë, secili funksion ka avantazhet dhe disavantazhet e tij (16).Në këtë kërkim, ne synojmë të kombinojmë studimet biokimike dhe të anasjellta gjenetike të koronaviruseve që përfaqësojnë dy gjinitë, dhe t'i vendosim gjetjet tona në sfondin evolucionar të mutacionit natyror të familjes së koronavirusit, në mënyrë që të fitojmë njohuri për këtë mbretëri misterioze.Ne raportojmë përparime të mëdha në të kuptuarit e NiRAN përmes identifikimit të objektivave natyrore në RTC, e cila (midis tre hipotezave të disponueshme) kontribuon në rolin e këtij domeni në fillimin e sintezës së ARN-së së virusit të mbivendosur.Ky hulumtim gjithashtu hap mundësi për role të tjera të NiRAN në ndërfaqen e hostit të virusit.
Për të karakterizuar vetitë enzimatike të domenit NiRAN të lidhur me virusin korona nsp12, ne prodhuam një formë rekombinante të koronavirusit njerëzor 229E (HCoV-229E) nsp12 në E. coli, me një etiketë His6 në fundin C dhe kombinuam proteina me [α32-P] Inkuboni së bashku me NTP në prani të MnCl2 siç përshkruhet në Materialet dhe Metodat.Analiza e produktit të reaksionit tregoi praninë e një proteine të etiketuar me radio që bashkë-migron me nsp12 (106 kDa), duke treguar se koronavirusi nsp12 katalizon formimin e adukteve kovalente proteine-NMP, të formuara preferencialisht me monofosfat uridine (UMP) (Figura 1A) Dhe B).Analiza sasiore tregoi se krahasuar me nukleotidet e tjera, intensiteti i sinjalit të përfshirjes së UMP u rrit me 2 deri në 3 herë (Figura 1C).Këto të dhëna janë në përputhje me aktivitetin e parashikuar të transferazës NMP të domenit NiRAN të koronavirusit (16), por tregojnë se preferencat e nukleotideve të domenit NiRAN të koronavirusit dhe virusit arterial janë të ndryshme.
Aktiviteti vetë-NMPilues i HCoV-229E nsp12.(A) HCoV-229E nsp12-His6 (106 kDa) u inkubua me [α-32P] NTP të caktuar në prani të 6 mM MnCl2 për 30 minuta (shih Materialet dhe Metodat për detaje).Produktet e reagimit u ndanë me SDS-PAGE dhe u ngjyrosën me blu të shkëlqyeshme Coomassie.(B) Proteina e etiketuar me radio vizualizohet me imazhe me fosfor.Pozicionet e nsp12-His6 dhe shënuesve të masës molekulare të proteinave (në kilodalton) tregohen në A dhe B. (C) Intensiteti i sinjalit radioaktiv (mesatarja ± SEM) u përcaktua nga tre eksperimente të pavarura.*P≤0.05.Fuqia e sinjalit (përqindja) lidhet me UTP.
Megjithëse aktivitetet e enzimës të lidhura me NiRAN janë treguar të jenë thelbësore për riprodhimin e EAV dhe SARS-CoV në kulturën e qelizave (16), funksioni specifik i NiRAN dhe objektivat e mundshëm nuk janë përcaktuar ende.Ngjashmëria strukturore e raportuar kohët e fundit midis NiRAN dhe një familjeje proteinash me palosje të ngjashme me proteina kinazë (17, 22) na shtyu të testonim hipotezën që NiRAN katalizon NMPilimin e proteinave të tjera.Ne gjeneruam një grup objektivash homologë potencialë, duke përfshirë proteina jo-strukturore të koduara nga HCoV-229E ORF1a (nsps 5, 7, 8, 9, 10), secila përmban një etiketë His6 të terminalit C (shtojca SI, Tabela S1) dhe inkuboni këto proteina me [α32-P] uridin trifosfat ([α32-P]UTP) në prani ose mungesë të nsp12.Albumina e serumit të gjedhit dhe proteina e bashkimit MBP-LacZα të prodhuara në E. coli shërbyen si kontrolle (Figura 2A, korsitë 1 deri në 7).Proteina e etiketuar me radio u analizua me elektroforezë me xhel dodecil sulfate-poliakrilamid natriumi (SDS-PAGE) dhe autoradiografi dhe u zbulua se kishte një sinjal të fortë radioaktiv në reaksionin që përmban nsp12 dhe nsp9.Pozicioni i sinjalit korrespondon me masën molekulare të nsp9, duke treguar UMPilimin e ndërmjetësuar nga nsp12 të nsp9 (Figura 2B, pista 7).Asnjë proteinë tjetër testuese nuk u gjet të ishte UMPylated, gjë që na bëri të konkludojmë se nsp9 është një substrat specifik i nsp12.Në përputhje me të dhënat e vetë-NMPilimit të treguar në Figurën 1, nsp12 është në gjendje të transferojë të katër NMP-të në nsp9, megjithëse efikasiteti është i ndryshëm, UMP> adenozinë monofosfat (AMP)> guanozinë monofosfat (GMP)> citidinë monofosfat (CMP)) Foto).3 A dhe B).Në kushtet e përdorura në këtë analizë (shkurtoni kohën e reagimit dhe ekspozimit, zvogëloni përqendrimin e nsp12; materialet dhe metodat), vetë-NMPilimi i nsp12 nuk mund të zbulohej (krahaso Figurën 2B, korsia 7 dhe Figura 1B), e cila rezultoi një efektiv (Dhe raunde të shumta) UMP u zhvendos nga nsp12 në nsp9.Aktiviteti i transferazës UMP kërkon praninë e joneve Mn2+, siç tregohet në figurën 3C, ndërsa vetëm aktiviteti minimal i transferazës UMP u vu re në prani të Mg2+ dhe asnjë aktivitet në prani të dy kationeve të tjerë dyvalente të testuara.Të dhëna të ngjashme u morën në analizat e NMPilimit që përmbajnë citidinë trifosfat (CTP), guanozinë trifosfat (GTP) dhe adenozinë trifosfat (ATP) (shtojca SI, Figura S1).
UMPilimi i nsp9 i ndërmjetësuar nga HCoV-229E nsp12.Një seri substratesh proteinash (përfshirë albuminën e serumit të gjedhit, MBP-lacZα dhe një seri HCoV-229E nsps të etiketuar me C-terminal His6 të koduar nga ORF1a) u përdorën për të vlerësuar aktivitetin e UMPilimit të HCoV-229E nsp12-His6⁺-mediated proteina.Inkuboni proteinën me [α-32P] UTP për 10 minuta në mungesë (A) ose pranisë (B) të nsp12 siç përshkruhet në materialet dhe metodat.Në krye të A dhe B, tregohet xhel SDS-polyakrilamid i njollosur me Coomassie Brilliant Blue, dhe në fund të A dhe B, tregohen autoradiogramet përkatëse.Pozicioni i shënuesit të masës molekulare të proteinave (në kilodalton) jepet në të majtë.Pozicioni i nsp12-His6 (B, lart) dhe sinjali radioaktiv i vëzhguar gjatë inkubimit të nsp12-His6 me nsp9-His6 (B, korsi 7) tregohen gjithashtu, gjë që tregon se [α-32P]UMP në nsp9-His6 (12.9 kDa), e cila nuk u vu re për proteinat e tjera të testuara.
Karakterizimi biokimik dhe virologjik i ndërmjetësuar nga HCoV-229E NiRAN i NMPilimit nsp9.(A dhe B) Roli i bashkësubstratit nukleotid që përdoret në reaksion.Nsp12-His6 dhe nsp9-His6 përzihen dhe inkubohen në prani të NTP-ve të ndryshme [α-32P] në analizën standarde të NMPilimit.(A, sipër) nsp9-His6 me njolla Coomassie e ndarë nga SDS-PAGE.(A, fund) Autoradiografi e së njëjtës zonë të xhelit.(B) Aktiviteti relativ (mesatarja ± SEM) në prani të kofaktorit nukleotid të caktuar përcaktohet nga tre eksperimente të pavarura.*P≤0.05.(C) Roli i joneve metalike.Tregohet testi standard i NMPilimit në prani të [α-32P] UTP dhe joneve të ndryshme metalike, secili me një përqendrim prej 1 mM.Në C, pjesa e sipërme, nsp9-His6 e ngjyrosur me Coomassie tregohet dhe në C, fundi, tregohet autoradiografia përkatëse.Madhësia e proteinës së etiketuar (në kilodalton) tregohet në të majtë të A dhe C. (D) Forma mutante e HCoV-229E nsp12-His6 që mbart zëvendësimin e specifikuar të aminoacideve është në [α-32P]UTP, siç përshkruhet në Materialet dhe Metodat.Nsp9-His6 i etiketuar me radio, i prodhuar në reaksionin e NMPilimit, zbulohet nga imazhi i fosforilimit (D, sipër).Aktiviteti relativ në krahasim me proteinën e tipit të egër (wt) tregohet në D, dhe fundi merret si mesatarja (±SEM) nga tre eksperimente të pavarura.Yjet tregojnë zëvendësimet e mbetjeve jo të konservuara.(E) Titri i virusit në supernatantin e kulturës së qelizave p1 i marrë 24 orë pas infeksionit u përcaktua me analizën e pllakës.Tregohen zëvendësimet e kodonit në domenin NiRAN të mutantit të projektuar HCoV-229E (numërimi i mbetjeve bazohet në pozicionin e tyre në pp1ab).Mutanti i vendit aktiv RdRp me mungesë replikimi nsp12_DD4823/4AA u përdor si kontroll.
Për të fituar një kuptim më të thellë të vendit aktiv të NiRAN dhe për të përcaktuar mbetjet që lidhen me aktivitetin e transferazës NMP specifike nsp9, ne kryem analizën e mutacionit, në të cilën zëvendësuam mbetjet konservative në motivet NiRAN AN, BN dhe CN ( 16) Është Ala (shtojca SI, Figura S2).Për më tepër, ndikimi i zëvendësimeve konservative Arg-to-Lys ose Lys-to-Arg u vlerësua në dy raste.Si një kontroll (negativ), mbetjet që nuk janë ose më pak të konservuara në domenin NiRAN të koronaviruseve dhe viruseve të tjerë të mbivendosur zëvendësohen me Ala. Duke zëvendësuar K4116A (në motivin preAN), K4135A (AN), R4178A (BN), D4188A (motiv BN) dhe D4280A (CN) redukton ose edhe eliminon ndjeshëm nsp9 NMPilimin përmes nsp12, ndërsa proteinat me zëvendësime konservative (R4178K), K4116R) ruajnë 60% dhe 80% të aktivitetit të tyre, gjë që tregon se relaksimi i kufizimeve në anën e tyre përkatëse zinxhirët janë fizikisht të ndjeshëm (Figura 3D).Zëvendësimi i disa mbetjeve të tjera të ruajtura E4145A, D4273A, F4281A dhe D4283A është shumë më pak i dëmshëm dhe nsp9 UMPylation është reduktuar vetëm mesatarisht.Rezultate të ngjashme u morën në reaksionet e nsp9 NMPilimit që përfshijnë NTP të tjera (Figura 3D dhe shtojca SI, Figura S3), duke konfirmuar se efektet e vëzhguara në zëvendësimet specifike të aminoacideve janë të pavarura nga lloji i bashkë-substratit nukleotid të përdorur.Më pas, ne testuam ndikimin e mundshëm të këtyre zëvendësimeve nsp12 në riprodhimin e koronaviruseve në kulturën qelizore.Për këtë qëllim, ne përdorëm shabllone të përshtatshme plotësuese të ADN-së (cDNA) të krijuara gjenetikisht të klonuara në virusin rekombinant vaccinia (23, 24) për të transkriptuar 5 -7 qeliza.Titrimi i pasardhësve të virusit infektiv të prodhuar në këto qeliza tregoi se shumica e mutantëve të NiRAN HCoV-229E nuk ishin të realizueshme (Figura 3E).Një grup mutantësh viralë jo të zbatueshëm përfshin alternativa që janë treguar se eliminojnë ose reduktojnë ndjeshëm aktivitetin e transferazës NMP in vitro (K4116A, K4135A, R4178A, D4188A, D4280A, D4283A), por ka dy alternativa të tjera (K4116R, E48145A) % e rezervuar?Aktiviteti i tyre in vitro NMPylation sugjeron që përfshihen kufizime shtesë.Në mënyrë të ngjashme, dy mutacione të tjera (R4178K, F4281A) që shkaktuan një ulje të moderuar të aktivitetit të NMPilimit in vitro të NiRAN-it, prodhuan viruse të gjalla, megjithatë, këto viruse reduktuan ndjeshëm titrat përmes replikimit.Në përputhje me të dhënat e aktivitetit in vitro të paraqitura në Figurën 3D, duke zëvendësuar katër mbetje të tjera që nuk janë ruajtur në koronavirus dhe/ose viruse të tjera të mbivendosur (K4113A, D4180A, D4197A, D4273A) (8, 16) prodhuan viruse të qëndrueshme. Pasardhësit, pavarësisht se kanë një titër mesatarisht i reduktuar në krahasim me virusin e tipit të egër (Figura 3E).
Për të studiuar nëse aktiviteti i NMP transferazës i ndërmjetësuar nga NiRAN varet nga domeni aktiv RdRp, dy mbetjet e konservuara Asp të përfshira në koordinimin e joneve metalike dyvalente (11) në motivin RdRp C u zëvendësuan nga Ala. Proteina që rezulton nsp12_DD4823/4AA ruan aktiviteti i tij i nsp9 NMPilimit, që tregon se aktiviteti in vitro nsp9 NMPilimi i ndërmjetësuar nga nsp12 nuk kërkon aktivitet polimerazë (Shtojca SI, Figura S4).
Pas vendosjes së aktivitetit të transferazës NMP-specifike nsp9 për nsp12, ne u përpoqëm të karakterizonim aduktin NMP-nsp9 me spektrometrinë e masës (MS).Spektri i plotë i masës së proteinave të HCoV-229E nsp9 rekombinant tregoi një kulm në 12,045 Da (Figura 4A).Shtimi i nsp12 nuk e ndryshoi cilësinë e nsp9, duke treguar se nsp12 dhe nsp9 nuk do të formonin një kompleks të qëndrueshëm në kushtet e përdorura (denaturimi) (Figura 4A).Në prani të UTP dhe GTP, matja e masës së reaksionit që përmban respektivisht nsp9 dhe nsp12 tregoi se masa proteinike e UTP lëvizi 306 Da, dhe masa proteinike e GTP lëvizi 345 Da, duke treguar se çdo molekulë nsp9 lidh një UMP ose GMP (Figura 4) C dhe D).Spekulohet se energjia e nevojshme për nsp9 NMPilimin e ndërmjetësuar nga NiRAN vjen nga hidroliza e NTP dhe lirimi i pirofosfatit.Megjithëse një tepricë molare 10-fish e nsp9 (objektivit) se nsp12 (enzima) u përdor në këtë reaksion, u vu re pothuajse i plotë NMPilimi i nsp9, duke treguar se ndërveprimi midis nsp12 dhe nsp9 është jetëshkurtër dhe nsp12 mund të NMPylate më shumë nsp9 molekulë in vitro.
NMPilimi i vetëm i nsp9 në prani të nsp12 dhe UTP ose GTP.Tregohet spektri masiv i plotë i proteinave i dekonvoluar i HCoV-229E nsp9 (shtojca SI, Tabela S1) (AD).(A) vetëm nsp9, (B) nsp9 + nsp12-His6, (C) nsp9 + nsp12-His6 në prani të UTP, (D) nsp9 + nsp12-His6 në prani të GTP.
Për të përcaktuar mbetjet nsp9 UMPiluar nga nsp12, nsp9-UMP u nda me tripsinë.Peptidet që rezultuan u ndanë me kromatografi të lëngshme me performancë të lartë nano (HPLC) dhe u analizuan me anë të spektrometrisë së masës së bashku (MS/MS) në internet.Analiza e të dhënave duke përdorur paketën softuerike Byonic (Protein Metrics) tregoi UMPilimin e aminoacidit N-terminal.Kjo konfirmohet me dorë.Spektri i masës së bashku i peptidit pararendës [UMP]NNEIMPGK (shtojca SI, Figura S5A) zbuloi një fragment në 421 m/z, duke treguar se UMP lidhet me mbetjen 1 të nsp9.
Në skajin N të nsp9, Asn ruhet midis anëtarëve të Orthocoronavirinae (shtojca SI, Figura S6).Edhe pse ne besojmë se azoti amine primar N-terminal është pranuesi më i mundshëm për UMP, ne vendosëm të marrim prova shtesë të lidhjes së NMP në terminalin N.Për këtë arsye, peptidi N-terminal jo-NMPylated dhe NMPylated nsp9 i pastruar me HPLC u përftua në prani të acetonit dhe cianoborohidridit të natriumit.Në këto kushte, vetëm aminet primare të lira mund të modifikohen me propil (25).Peptidi N-terminal i përftuar nga nsp9 me sekuencën NNEIMPGK përmban dy amina primare, njëra në skajin N të Asn dhe tjetra në zinxhirin anësor të Lys në fundin C.Prandaj, grupet e propilit mund të futen në të dy skajet.Kromatogramet jonike të ekstraktuara të peptideve jo-NMPylated tregohen në shtojcën SI, Figura S5B.Ashtu siç pritej, mund të identifikohen (mono)propiluara me N-terminal dhe C-terminal (shtojca SI, Figura S5B, korsia e sipërme) dhe peptidet e dipropiluara (shtojca SI, Figura S5B, korsia e poshtme).Ky model ndryshon me përdorimin e peptidit N-terminal të NMPiluar të nsp9.Në këtë rast, mund të identifikohen vetëm peptidet e propiluara me C-terminal, por peptidet e propiluara me terminale N dhe peptidet e dipropiluara nuk identifikohen (Shtojca SI, Figura S5C), duke treguar që UMP është transferuar në aminë primare N-terminale Për të parandaluar këtë. grupi nga bërja e ndryshimeve.
Më pas, ne zëvendësojmë (me Ala ose Ser) ose fshijmë mbetjet e ruajtura në fundin N të nsp9 për të përcaktuar kufizimet specifike të objektivit.Bazuar në të dhënat tona MS që tregojnë se NiRAN formon një adukt nsp9-NMP me aminën primare të mbetjes N-terminale të nsp9, ne supozuam se nsp9 NMPylation kërkon që proteaza kryesore virale (Mpro, nsp5) të çlirojë terminalin nsp9 N nga pararendësi i saj poliproteinik.Për të testuar këtë hipotezë, ne prodhuam një proteinë pararendëse nsp7-11 që përmban nsp9 në E. coli dhe kryem një test standard NMPylation në prani të [α-32P] UTP (materiale dhe metoda).Siç tregohet në figurën 5A (korsi 3), pararendësi i paprerë nsp7-11 nuk është radioetiketuar me nsp12.Në të kundërt, nëse nsp7-11 copëtohet nga nsp5 rekombinant për të çliruar nsp9 (dhe nsps të tjera) nga prekursori, zbulohet një proteinë e etiketuar me radio që migron me nsp9, duke konfirmuar përfundimin tonë se NiRAN dhe N- formimi selektiv i addukteve kovalente nsp9-NMP .Amina primare terminale e N-terminalit Asn (pozicioni 3825 në pp1a/pp1ab).Ky përfundim mbështetet gjithashtu nga eksperimentet duke përdorur konstruktin nsp9, i cili përmban një ose dy mbetje shtesë në fundin N.Në të dyja rastet, UMPilimi i ndërmjetësuar nga NiRAN i nsp9 u anulua (Shtojca SI, Figura S7).Më pas, ne prodhuam një proteinë me një ose dy mbetje Asn të fshira nga sekuenca peptide 3825-NNEIMPK-3832 në terminalin N të nsp9.Në të dyja rastet, nsp9 UMPylation u bllokua plotësisht (Figura 5B), duke siguruar prova shtesë se fundi i vërtetë nsp9 N vepron si një receptor NMP.
Përpunimi proteolitik i nsp9 dhe roli i mbetjeve N-terminale në UMPilimin e ndërmjetësuar nga nsp12.(A) UMPilimi nsp9 kërkon një terminal të lirë nsp9 N.Nsp7-11-His6 është inkubuar paraprakisht në 30 °C në buferin e zbulimit të NMPylation që përmban UTP në prani ose mungesë të Mpro rekombinant (nsp5-His6).Pas 3 orësh, filloni analizën e NMPylation duke shtuar nsp12-His6 siç përshkruhet te Materialet dhe Metodat.Reaksioni që përmban nsp5-His6 (korsi 1) dhe nsp9-His6 (korsi 2) u përdor si kontroll.Pas 10 minutash, reaksioni u ndërpre dhe përzierja e reaksionit u nda me SDS-PAGE.Proteina u ngjyros me Coomassie Brilliant Blue (A, sipër).Pararendësi Nsp7-11-His6 dhe produkti i përpunuar që rezulton nga ndarja e ndërmjetësuar nga nsp5-His6 janë paraqitur në të djathtë.Ju lutemi vini re (për shkak të madhësisë së tyre të vogël) se nsp7 dhe nsp11-His6 nuk janë të dallueshme në këtë xhel dhe reagimi plotësohet me nsp5-His6 (korsitë 1 dhe 4; pozicioni i nsp5-His6 tregohet nga një rreth i fortë) ose nsp9-His6 (Rruga 2) përmban një sasi të vogël MBP (treguar me rrathë të hapur) si papastërti të mbetura sepse ato shprehen si proteina të shkrirjes MBP (shtojca SI, Tabela S1).(B) Variantit Nsp9-His6 i mungojnë një ose dy mbetje N-terminale Asn (numërimi i mbetjeve sipas pozicionit në pp1a/pp1ab) dhe pastrohet dhe inkubohet me nsp12-His6 dhe [α-32P] UTP.B, SDS-PAGE e njollosur me Coomassie tregohet në krye, B, autoradiografia përkatëse është paraqitur në fund.Pozicioni i shënuesit të peshës molekulare (në kilodalton) tregohet në të majtë.(C) Mbetjet e konservuara të HCoV-229E nsp9-His6 N-terminale u zëvendësuan me Ala ose Ser, dhe e njëjta sasi proteine u përdor në reagimin UMPylation të ndërmjetësuar nga nsp12-His6.Produktet e reaksionit u ndanë me SDS-PAGE dhe u ngjyrosën me Coomassie Brilliant Blue (C, sipër), dhe nsp9-His6 e etiketuar me radio u zbulua me imazhe me fosforeshencë (C, e mesme).Duke përdorur proteinën e tipit të egër (wt) si referencë (të vendosur në 100%), aktiviteti relativ i NMPilimit (mesatarja ± SEM) u llogarit nga tre eksperimente të pavarura.(D) Titrat e virusit në supernatantin e kulturës së qelizave p1 të qelizave Huh-7 të infektuara me qeliza HCoV-229E të tipit të egër Huh-7 dhe mutantët që mbajnë zëvendësime të përcaktuara të aminoacideve në nsp9 u përcaktuan me analizën e pllakës.Motivi RdRp me mungesë replikimi C mutant i dyfishtë DD4823/4AA u përdor si kontroll negativ.
Fundi N i nsp9 (veçanërisht pozicionet 1, 2, 3 dhe 6) është shumë i ruajtur midis anëtarëve të nënfamiljes Orthocoronavirinae (shtojca SI, Figura S6).Për të studiuar rolin e mundshëm të këtyre mbetjeve në nsp9 NMPilimin e ndërmjetësuar nga nsp12, dy mbetje të njëpasnjëshme të Asn në fundin N të nsp9 u zëvendësuan me Ala ose Ser (vetëm ose në kombinim).Krahasuar me nsp9 të tipit të egër, zëvendësimi i N3825 me Ala ose Ser rezultoi në një reduktim më shumë se dyfish të UMPilimit të ndërmjetësuar nga nsp12 (Figura 5C).Në përputhje me përfundimin tonë se NMPilimi ndodh në aminën primare N-terminale në vend të zinxhirit anësor të mbetjes N-terminale, ne vërejtëm NMPilim të rëndësishëm të mbetur me zëvendësimin e N3825A dhe N3825S.Është interesante, nëse Asn-i i dytë zëvendësohet nga Ala ose Ser, nsp9 UMPylation zvogëlohet më fuqishëm (më shumë se 10 herë), ndërsa zëvendësimi i Ala në pozicionet 3, 4 dhe 6 ka vetëm një efekt të moderuar në nsp9 UMPylation (Figura 2 ) .5C).Rezultate të ngjashme u morën duke përdorur ATP, CTP ose GTP (shtojca SI, Figura S8).Së bashku, këto të dhëna tregojnë rolin kryesor të N2826 (pozicioni 2 në nsp9) në nsp9 NMPylation.
Për të marrë prova shtesë të korrelacionit funksional midis terminalit N të nsp9 dhe NMPylation, ne kryem një rreshtim të sekuencave të shumëfishta (MSA) të sekuencës nsp9 të familjes së Coronavirus (që varion midis 104 dhe 113 mbetje) (Shtojca SI, Figura S6).Në total, në 47 lloje (të njohura dhe të supozuara) të 5 gjinive të nënfamiljes Orthocoronavirinae që infektojnë gjitarë, zogj dhe zvarranikë të ndryshëm, vetëm 8 mbetje në total u gjetën të jenë të pandryshueshme.Ndryshimet më të gjera, duke përfshirë fshirjet dhe futjet, u vunë re në ciklet midis elementeve të strukturës dytësore të nsp9, siç përcaktohet nga studimet e mëparshme strukturore (26 ??28).Pesë mbetje të pandryshueshme u gjetën në vargun β dhe heliksin α të pjesës C-terminale të nsp9.Tre mbetje të pandryshueshme përbëjnë motivin NNE të terminalit N të nsp9.Zbulohet se Asn-i i dytë i këtij motivi është e vetmja mbetje e pandryshueshme, e cila ndahet edhe nga nsp9 hipotetike e koronavirusit të bretkosave të lidhura në distancë, dhe përfaqëson specien Microhyla letovirus 1 në nënfamiljen Letovirinae të Alphaletovirus.Ruajtja e mbetjeve në elementët e strukturës dytësore nsp9 mund të racionalizohet nga konsideratat strukturore për të ruajtur vetitë e palosshme ose të njohura të lidhjes së ARN-së.Megjithatë, ky arsyetim nuk duket se zbatohet për ruajtjen e NNE, dhe para këtij studimi, natyra e kufizimeve që kufizojnë ndryshimin e sekuencës së tripeptideve ishte plotësisht e errët.
Për të përcaktuar rëndësinë e ruajtjes së nsp9-NMPilimit dhe NNE në replikimin e koronavirusit, ne prodhuam mutantë HCoV-229E, të cilët mbartin zëvendësime të vetme ose të dyfishta të mbetjeve nsp9 N-terminale, duke treguar se nsp9 NMPilimi është i dëmshëm in vitro.Para se të fillojmë, ne përpiqemi t'i përgjigjemi pyetjes nëse këto zëvendësime (pranë vendit të ndarjes nsp8|9) ndikojnë në përpunimin proteolitik të rajonit C-terminal pp1a.Një grup konstruksionesh poliproteinike nsp7-11 që përmbajnë zëvendësimet përkatëse në skajin N të nsp9 u prodhuan në E. coli dhe u prenë me Mpro rekombinant.Ndarja proteolitike e katër vendeve (përfshirë vendin e krahut nsp9) nuk ndikohet ndjeshëm nga ndonjë zëvendësim i futur (shtojca SI, Figura S9), duke përjashtuar ndryshimet strukturore në këto proteina që ndërhyjnë me ndarjen nsp8|9 të ndërmjetësuar nga Mpro (ose të tjera) faqe interneti.
Qelizat Huh-7 u transfektuan me ARN HCoV-229E me gjatësi gjenomi, duke koduar zëvendësimet Ala ose Ser në tripeptidet e konservuara NNE (N3825, N3826 dhe E3827) në fundin nsp9 N, duke treguar se shumica e mutacioneve janë fatale.Ne ishim në gjendje të shpëtonim virusin duke zëvendësuar Ser ose Ala të terminalit N Asn (N2835A ose N2835S), por nuk arritëm të rikuperojmë virusin me mutacione të tjera të vetme dhe të dyfishta në sekuencën NNE (N3826A, N3826S, NN3825/6AA, NN3825/6SS), E3827A) (Figura 5D).
Këto rezultate tregojnë se riprodhimi i koronaviruseve në kulturën e indeve është i kufizuar (i njëjtë ose i ngjashëm), duke kufizuar mutacionin natyror të vendeve të nsp9 NMPylation në trup dhe duke mbështetur rolin kryesor të kësaj përgjigjeje në ciklin jetësor të koronaviruseve.
Në grupin e fundit të eksperimenteve, ne prodhuam C-terminalin His6 të etiketuar SARS-CoV-2 nsp12 dhe nsp9, dhe dy forma mutante të nsp12 në E. coli.Mbetjet e faqes aktive në domenet NiRAN dhe RdRp ishin përkatësisht Use Ala në vend të tyre (Figura 6A dhe shtojca SI, Tabela S2).K4465 në SARS-CoV-2 nsp12 korrespondon me K4135 në HCoV-229E (Shtojca SI, Figura S2), e cila rezultoi të jetë e nevojshme për aktivitetin NiRAN dhe replikimin HCoV-229E (Figura 3D dhe E).Kjo mbetje korrespondon gjithashtu me mbetjen e virusit arterial EAV nsp9 K94, i cili më parë u tregua i nevojshëm për vetë-UMPilimin/vetë-GMPilimin NiRAN (16).Siç tregohet në figurën 6B, SARS-CoV-2 nsp12 ka aktivitet UMP transferazë duke përdorur nsp9 si një substrat, ndërsa mutant i faqes aktive nsp12_K4465A është joaktiv.Zëvendësimi i dyfishtë në sekuencën karakteristike SDD të motivit RdRp C nuk ndikon në aktivitetin e transferazës UMP (Figura 6B), duke treguar se aktiviteti RdRp nuk ka efekt të drejtpërdrejtë në nsp9 UMPylation.Të dhëna të ngjashme u morën duke përdorur CTP, GTP dhe ATP (shtojca SI, Figura S10).Në përmbledhje, këto të dhëna tregojnë se nsp9 NMPylation i ndërmjetësuar nga NiRAN ka një aktivitet konservativ në koronaviruset që përfaqësojnë gjini të ndryshme të nënfamiljes së ortokoronaviruseve.
NMPilimi i ndërmjetësuar nga SARS-CoV-2 nsp12 i nsp9.(A) Xhel SDS-polyakrilamid i ngjyrosur me Coomassie që tregon proteinën rekombinante të përdorur në testin e NMPilimit.Si kontroll, u përdor një proteinë mutant me zëvendësim të faqes aktive në domenin NiRAN (K4465A) dhe domenin RdRp (DD5152/3AA) të SARS-CoV-2 nsp12.Numërimi i mbetjeve bazohet në pozicionin në pp1ab.(B) Autoradiografi e zbulimit të UMPilimit duke përdorur nsp9-His6 dhe [α-32P]UTP si substrat të nsp12-His6 (lloji i egër [wt] dhe mutant).Masa molekulare (në kilodalton) e proteinës së etiketuar tregohet në të majtë.
Domenet NiRAN përgjithësisht ruhen në Nidovirales (16), duke treguar se ato katalizojnë reaksionet enzimatike thelbësore për replikimin e Nidovirusit.Në këtë studim, ne ishim në gjendje të vërtetonim se domeni NiRAN i koronavirusit transferon NMP (të gjeneruar nga NTP) në nsp9, një proteinë misterioze lidhëse e ARN-së e përfshirë në riprodhimin e virusit (26 ?? 29 ), për ta përcaktuar atë si një objektiv natyror dhe partner i koronavirusit RTC.
Domeni NiRAN ndan tre motive sekuence (AN, BN dhe CN), të cilat përmbajnë një numër shumë të vogël mbetjesh që ruhen në të gjitha familjet në rendin monofiletik, por shumë të diferencuar Nidovirales (8, 16).Studimet e fundit kanë treguar se ato janë strukturore të lidhura me një familje kryesisht të pakarakterizuar të proteinave të ngjashme me proteina kinase, të cilat fillimisht u quajtën familja SelO (17, 19, 22, 30, 31).Proteinat e lidhura me SelO kanë palosje kinaze, por u mungojnë disa mbetje aktive të konservuara në kinazat klasike (22, 32).Bazuar në orientimin e kundërt të molekulave ATP të lidhura në zonën aktive dhe të stabilizuara nga ndërveprime specifike, SelO u hipotezua dhe më pas u konfirmua se transferonte AMP (në vend të fosfatit) në substratin e proteinës (22), ndërsa një proteinë tjetër bakteriale e ngjashme me SelO-në YdiU ka kohët e fundit është treguar se katalizon lidhjen kovalente të UMP me Tyr dhe mbetjet e tij të substrateve të ndryshme proteinike (33).
Për të konfirmuar dhe zgjeruar parashikimin e mbetjeve të supozuara të vendit aktiv të domenit të koronavirusit NiRAN, ne përdorëm metoda biokimike dhe gjenetike të kundërt për të kryer analizën e mutacionit në koronavirusin nsp12 (Figura 3D dhe shtojca E dhe SI, Figura S3 dhe tabela) S1â S4).Të dhënat tregojnë se zëvendësimi i HCoV-229E K4135, R4178 dhe D4280 me Ala eliminon in vitro aktivitetin e NMP transferazës dhe riprodhimin e virusit në kulturën qelizore (Figura 3D dhe shtojcat E dhe SI, Figura S3), duke mbështetur praninë e tyre në γ-fosfat NTP ( K4135, R4178) dhe koordinimi i joneve metalike të zonës aktive (D4280).Zëvendësimi E4145A i Glu-së së konservuar në rangun e virusit të folesë së shpendëve, i parashikuar për të stabilizuar pozicionin K4135 (17) u tregua për të eliminuar replikimin viral, por çuditërisht, aktiviteti u mbajt në analizën in vitro NMPylation (Figura 3D dhe E dhe Shtojca SI, Figura S3 dhe Tabelat S1–S4).Një vëzhgim i ngjashëm u bë kur zëvendësimi përkatës u prezantua në homologun YdiU të Salmonella typhimurium (E130A) (33).Të marra së bashku, këto të dhëna mbështesin funksionin rregullues të kësaj mbetjeje të konservuar dhe jo funksionin katalitik.
Zëvendësimi i mbetjes së konservuar Phe (F4281A) brenda intervalit të nestovirusit në domenin HCoV-229E NiRAN (8) rezultoi në një ulje të aktivitetit të NMPilimit in vitro dhe një rënie të konsiderueshme në replikimin e virusit në kulturën qelizore (Figura 3D, E dhe SI) shtojca, Figura S3).Të dhënat përputhen me funksionin e rëndësishëm rregullator të kësaj mbetjeje, siç është motivi homolog DFG, mbetja Phe e treguar më parë.Në proteinkinazat klasike, ajo është pjesë e lakut lidhës Mg2+ dhe ndihmon në grumbullimin dhe rregullimin e shtyllës kurrizore???Kërkohet për aktivitet katalitik efektiv (32, 34).Zëvendësimi i mbetjeve të K4116 me Ala dhe Arg (në motivin preAN), përkatësisht, eliminoi replikimin viral dhe, siç pritej, pati efekte të ndryshme në aktivitetin e transferazës NMP in vitro, në varësi të zinxhirit anësor të aminoacideve të prezantuar (Figura 3D dhe E dhe shtojcat SI , Figura S3).Të dhënat funksionale janë në përputhje me informacionin strukturor, duke treguar se kjo mbetje ka krijuar një ndërveprim me fosfatin ATP (17).Në domenin NiRAN të familjeve të tjera të mbivendosura të viruseve, pozicioni i HCoV-229E pp1a/pp1ab K4116 është i zënë nga Lys, Arg ose His (8), duke treguar se kufizimi funksional i kësaj mbetjeje specifike është relaksuar.Zëvendësimi i D4188A dhe D4283A eliminon ose redukton fuqishëm aktivitetin e enzimës dhe eliminon replikimin e virusit (Figura 3).Këto dy mbetje ruhen në shumicën (por jo të gjithë) viruset e mbivendosur (8), duke treguar një funksion të rëndësishëm specifik të familjes, por ndoshta jo katalitik.Zëvendësimet Ala të disa mbetjeve të tjera Lys dhe Asp (K4113A, D4180A, D4197A dhe D4273A) që nuk janë të ruajtura në Coronaviridae ose familje të tjera Nestioviridae (8) janë përdorur si kontrolle.Siç pritej, këto zëvendësime janë kryesisht të tolerueshme, me një rënie të lehtë në aktivitetin e enzimës dhe replikimin viral në disa raste (Figura 3 dhe shtojca SI, Figura S3).Në përgjithësi, të dhënat e mutagjenezës së koronavirusit janë shumë në përputhje me të dhënat e vetë-GMP dhe të gjenetikës së kundërt të EAV NiRAN-RdRp (16), në të cilën EAV nsp9 (orthologu i koronavirusit nsp12) K94 (që korrespondon me HCoV-229E K4135) funksionon të rëndësishëm), R124 (që korrespondon me R4178), D132 (që korrespondon me D4188), D165 (që korrespondon me D4280), F166 (që korrespondon me F4281).Për më tepër, të dhënat e mutagjenezës së HCoV-229E janë në përputhje dhe zgjerohen nga të dhënat gjenetike të kundërta të raportuara më parë të SARS-CoV (16), po aq shumë të ngjashme me ato të vëzhguara për motivin korrespondues CN mutant Phe-to-Ala SARS-CoV_nsp12 fenotipi i përshkruar -F219A dhe HCoV-229E_F4281A (Figura 3 D dhe E dhe shtojca SI, Figura S3 dhe Tabela S1-S4).
Krahasuar me ortologët EAV (16), të cilët kanë një preferencë të qartë për UTP dhe GTP (në reagimin e vetë-NMPilimit), studimi ynë tregon se domeni i koronavirusit NiRAN (i përfaqësuar nga HCoV-229E dhe SARS-CoV-2) mund të jetë efektiv. transferuar Të katër NMP-të, megjithëse ka një preferencë të lehtë për UMP-në (Figurat 1 dhe 3).Specifikimi relativisht i ulët i bashkë-substratit specifik NTP është në përputhje me strukturën superkompozite nsp7/8/12/13 të raportuar së fundmi SARS-CoV-2, në të cilën ADP-Mg2+ lidhet me zonën aktive të NiRAN, por jo me Pjesën e adeninës. të formimit të ndërveprimeve specifike (17).Në studimin tonë, lloji i nukleotidit i përdorur në reaksionin e NMPilimit nuk ka efekt diferencial në aktivitetin e proteinës mutant (Shtojca SI, Figura S3), duke treguar se asnjë nga këto mbetje nuk është i lidhur ngushtë me lidhjen e një nukleobaze specifike.Baza strukturore dhe rëndësia e mundshme biologjike e preferencave të ndryshme të bashkë-substratit NTP të vërejtura në domenet NiRAN të koronaviruseve dhe viruseve arteriale mbeten për t'u studiuar;ato mund të jenë të vërteta ose mund të jenë për shkak të kufizimeve të studimeve të tyre përkatëse.Aktualisht, nuk mund të përjashtohet që aktiviteti i mundshëm NMPylator i domenit të virusit arterial NiRAN (krahasuar me aktivitetin e vetë-NMPilimit të karakterizuar më parë) të ketë një preferencë të ndryshme bashkësubstrati, duke marrë parasysh që ngjashmëria midis arterialit dhe koronavirusit Domeni NiRAN është në kufirin e tij.Krahasoni bazuar në sekuencë (16).Krahasuar me pseudokinazën SelO, e cila përdor Mg2+ si kofaktor, aktiviteti i koronavirusit dhe virusit arterial NiRAN varet nga Mn2+ (16) (Figura 3C dhe shtojca SI, Figura S1).Varësia e Mn2+ dhe preferenca e dukshme për UTP është një tipar i pazakontë i NMPylatorëve të proteinave dhe është konfirmuar vetëm kohët e fundit në proteinën YdiU të Salmonella typhimurium, e cila katalizon UMPilimin e rreptë të proteinës së varur nga Mn2+ për të mbrojtur qelizat nga grupi i ATP-ve të qelizave të induksionit të stresit. 33).
Ngjashmëria strukturore e përshkruar kohët e fundit midis domenit të koronavirusit NiRAN dhe proteinave kinazave qelizore (17, 19) ofron mbështetje shtesë për aftësinë e NiRAN për të lidhur në mënyrë kovalente NMP me proteinat e tjera që kemi raportuar në këtë studim.Ne e fokusuam kërkimin tonë për objektivat e mundshëm të NiRAN në proteinat e koduara nga HCoV-229E ORF1a, të cilat dihet se ndihmojnë drejtpërdrejt ose tërthorazi replikazën e koduar me ORF1b të RTC (12, 35).Eksperimentet tona ofrojnë prova përfundimtare për NMPilimin efektiv dhe specifik të nsp9 (Figura 2).Nëse proteina e synuar përdoret në një tepricë molare që është 8 deri në 10 herë më e lartë se ajo e enzimës (nsp12), konfirmohet se nsp9 është plotësisht (mono)NMPizuar (Figura 4).Ne arritëm në përfundimin se ndërveprimi midis nsp12 dhe nsp9 është jetëshkurtër dhe nuk do të formojë një kompleks të qëndrueshëm me nsp9 (në mungesë të njësive të tjera RTC).Ky përfundim mbështetet nga studimet e ndërveprimit të proteinave në proteomën SARS-CoV (35).Analiza MS identifikoi aminën primare të mbetjes N-terminale të nsp9 si vend NMPilimi (shtojca SI, Figura S5).Formimi i lidhjes fosforamidatike dhe grupit amino N-terminal dallon aktivitetin e NMPilimit të ndërmjetësuar nga NiRAN nga reaksioni i AMPilimit të ndërmjetësuar nga SelO i Pseudomonas syringae, i cili katalizon formimin e AMP-së të lidhur me O në mbetjet e Ser, Thr ose Tyr në adduktin e peptidit. 22), dhe S. typhimurium YdiU formon addukte peptide-UMP të lidhura me O (me Tyr) dhe N-të lidhur (me His).Informacioni i kufizuar i disponueshëm për familjen e proteinave SelO tregon se anëtarët e kësaj familjeje të madhe proteinash ndryshojnë shumë në formimin e addukteve peptide-NMP.Ky është një vëzhgim interesant që meriton studim të mëtejshëm.
Të dhënat e marra në këtë studim na çuan në hipotezën se NMPilimi i nsp9 kërkon një N-terminus të lirë.Në kontekstin e replikimit viral, kjo do të sigurohet nga ndarja proteolitike e vendit të përpunimit nsp8|nsp9 në poliproteinën replikase pp1a të ndërmjetësuar nga Mpro dhe pp1ab.Në shumicën e koronaviruseve, ndryshimi midis këtij siti specifik (VKLQ|NNEI në HCoV-229E) dhe të gjitha vendeve të tjera të ndarjes së koronavirusit Mpro është Asn (në vend të një mbetjeje tjetër të vogël, si Ala, Ser ose Gly) që zë P1â???Vendndodhja (36).Të dhënat e ndarjes së peptideve të marra në studimet e hershme treguan se efikasiteti i ndarjes së vendit nsp8|nsp9 ishte më i ulët se ai i vendeve të tjera, duke treguar se 1) ky vend specifik mund të ketë një rol rregullator në përpunimin e koordinuar në kohë të C-terminalit rajoni pp1a, ose 2) a Roli i nsp9 N-terminusit të konservuar special në replikimin e virusit (37).Të dhënat tona (Figura 5A) treguan se forma rekombinante e nsp9 që mbante sekuencën reale N-terminale u NMPizua në mënyrë efektive nga nsp12.Sekuenca anësore N-terminale u hoq nga faktori Xa (nsp9-His6; shtojca SI, Tabela S1) ose shkëputja e ndërmjetësuar nga Mpro (nsp7-11-His6; Figura 5A dhe shtojca SI, Tabela S1).E rëndësishmja, pararendësi i paprerë që përmban nsp9 nsp7-11-His6 tregoi rezistencë ndaj NMPilimit të nsp12, që është në përputhje me të dhënat tona, duke treguar se adukti nsp9-NMP është formuar përmes aminës primare N-terminale (shtojca SI, Figura S5) .Për të fituar një kuptim më të thellë të specifikës së substratit NiRAN, ne më pas u fokusuam në mbetjet N-terminale ngjitur të nsp9.Në mungesë të proteinave të tjera, ato janë strukturore fleksibël, duke i penguar ato të zbulohen në formën e paetiketuar të nsp9 (26 28, 38), duke treguar variacionin e tyre të kufizuar natyror. Kjo është për shkak të rëndësisë specifike të sekuencës (jo e lidhur me strukturën dytësore) funksioni i fragmentit N-terminal nsp9.Zëvendësimet Ala të mbetjeve të konservuara në këtë rajon (Figurat 5C dhe D dhe shtojca SI, Figura S8) zbulojnë se N3826 është thelbësor për nsp9 NMPilimin in vitro, ndërsa zëvendësimet e N3825A dhe E3827A çojnë në një ulje të NMPilimit, ndërsa zëvendësimet e M3829A dhe P38 nuk bëjnë. .Natyrisht ndikon në NMPylation nsp9.Megjithëse zëvendësimi i Asn-terminalit N (N3825A, N3825S) ka vetëm një efekt të moderuar në nsp9 NMPilimin dhe replikimin e virusit në kulturën qelizore (Figura 5C dhe D), fshirja e një sekuence mbetjeje Asn nga dipeptidi N-terminal 3825-NN Është vërtetuar se është vdekjeprurëse për viruset, duke treguar se kërkohet një mbetje Asn përpara një mbetjeje tjetër në terminalin N, mundësisht Asn, megjithëse duket se zëvendësimi i mbetjeve të ngjashme mund të tolerohet pjesërisht (Figura 5B, C dhe D).Ne konkludojmë se dipeptidi 3825-NN, veçanërisht mbetja e konservuar dhe thelbësore N3826 brenda gamës së koronavirusit (shtojca SI, Figura S6), siguron lidhjen dhe orientimin e saktë të terminalit nsp9 N në zonën aktive të NiRAN.
Zëvendësimi i Alas (E3827A) për Glu-në e konservuar të të gjitha nënfamiljeve ruan nsp9 NMPilimin in vitro, por është vdekjeprurës për viruset në kulturën qelizore (Figura 5C dhe D), duke treguar funksionin shtesë të kësaj mbetjeje, për shembull, në ndërveprimet kryesore (NMPiluar ose të pamodifikuar ) nsp9 N-terminus dhe faktorë të tjerë të përfshirë në riprodhimin e virusit.Mutacionet Nsp9 nuk ndikuan në procesin proteolitik të nsp9 ose ndonjë nsps ngjitur (39) (Shtojca SI, Figura S9), duke treguar se fenotipet vdekjeprurëse të disa mutacioneve nsp9 të vëzhguara nuk ishin shkaktuar nga disrregullimi i zonës pp1a të procesit proteolitik C-terminal. .
Të dhënat e mësipërme ofrojnë dëshmi se pas trajtimit të ndërmjetësuar nga Mpro të vendit të ndarjes nsp8|9 në pp1a/pp1ab, fundi N i nsp9 mund të UMPilohet (ose modifikohet pjesërisht me një NMP tjetër).Për më tepër, ruajtja e shkëlqyer e terminalit N të nsp9 (përfshirë mbetjet e Asn singulare dhe të pandryshueshme në familjen e koronavirusit) dhe të dhënat e kundërta gjenetike të marra në këtë studim (Figurat 3E dhe 5D) na çuan në përfundimin se nsp9 NMPylimi i përshkruar është i lidhur biologjikisht dhe thelbësor për riprodhimin e koronavirusit.Pasojat funksionale të këtij modifikimi mbeten për t'u studiuar, për shembull, në lidhje me aktivitetin lidhës të ARN-së (2628) të përshkruar më parë (jo specifike) nsp9 (formë e pamodifikuar).NMPilimi N-terminal mund të ndikojë gjithashtu në ndërveprimin e nsp9 me proteinat ose substratet e ARN-së ose në formimin e asambleve të ndryshme me katër nivele.Këto janë vërejtur në studimet strukturore dhe janë konfirmuar se lidhen funksionalisht me riprodhimin e koronavirusit, megjithëse veçanërisht në mungesë të Në rastin e këtij modifikimi (26- ââ29, 40).
Megjithëse specifika e synuar e domenit të koronavirusit NiRAN ende duhet të karakterizohet më në detaje, të dhënat tona tregojnë se specifika e objektivit të proteinës së domenit të koronavirusit NiRAN është shumë e ngushtë.Megjithëse ruajtja e mbetjeve kryesore të zonës aktive (8, 16) në domenin NiRAN të të gjitha familjeve nidovirus mbështet fuqimisht aktivitetin e këtyre proteinave NMPylator të konservuar, identiteti i mbetjeve të xhepit lidhës të substratit të këtij domeni Ruajtja dhe ruajtja mbetet për t'u karakterizuar , dhe mund të ndryshojnë midis familjeve të ndryshme të qëllimeve Nidovirales.Në mënyrë të ngjashme, objektivat përkatëse të viruseve të tjerë të mbivendosur ende nuk janë përcaktuar.Ato mund të jenë ortologë të largët të nsp9 ose proteinave të tjera, sepse sekuencat jashtë pesë domeneve replikase që ruhen përgjithësisht në viruset e mbivendosur janë më pak të konservuara (8), duke përfshirë grupin e gjenomit midis Mpro dhe NiRAN, Midis tyre, nsp9 ndodhet në koronavirus.
Për më tepër, aktualisht nuk mund të përjashtojmë mundësinë që domeni NiRAN të ketë objektiva shtesë (përfshirë celularë).Në këtë rast, vlen të përmendet se homologët bakterialë në këtë proteinë NMPylators (NMPylators) (30, 31) duket se kanë "rregullatorë kryesorë"?NMP modulon një sërë proteinash qelizore për të rregulluar ose eliminuar aktivitetet e tyre në rrjedhën e poshtme, duke luajtur kështu një rol në një sërë procesesh biologjike, të tilla si reagimi i stresit qelizor dhe homeostaza redoks (22, 33).
Në këtë studim (Figura 2 dhe 4 dhe Shtojca SI, Figura S3 dhe S5), ne ishim në gjendje të vërtetonim se nsp12 transferoi pjesën UMP (NMP) në një pozicion të vetëm (të konservuar) në nsp9, ndërsa proteinat e tjera nuk u modifikuan në përdoret Sipas kushteve, mbështetet specifika e substratit të përcaktuar mirë (në vend të lirshme).Në përputhje me këtë, krahasuar me NMPilimin N-terminal nsp9, aktiviteti i vetë NMPilimit të nsp12 është shumë i ulët, zbulimi i tij kërkon kohë më të gjatë ekspozimi në autoradiografi dhe përdoret një rritje 10-fish në përqendrimin e nsp12.Për më tepër, analiza jonë e MS nuk arriti të sigurojë prova për NMPilimin e nsp12, gjë që sugjeron se vetë-NMPilimi i domenit NiRAN është (në rastin më të mirë) një aktivitet dytësor.Megjithatë, duhet të theksohet se studime të tjera kanë ofruar prova paraprake se statusi i vetë-AMPilimit të NMPylatorit bakterial mund të kontrollojë aktivitetin e tyre të NMPilimit në substrate të tjera proteinike (22, 33).Prandaj, nevojiten më shumë kërkime për të hetuar efektet e mundshme funksionale të aktiviteteve të vetë-NMPilimit të raportuara për EAV nsp9 (16) dhe koronavirus nsp12 (ky studim), duke përfshirë efektin e propozuar të ngjashëm me personelin në palosjen e domenit C-terminal RdRp ( 16)).
Më parë, janë marrë në konsideratë disa hipoteza në lidhje me funksionet e mundshme në rrjedhën e poshtme të domenit nidoviral NiRAN, duke përfshirë ligazën ARN, transferazën guanilate të mbuluar me ARN dhe aktivitetin priming të proteinave (16), por asnjëra prej tyre nuk është në përputhje me funksionet e disponueshme në rrjedhën e poshtme.Informacioni i marrë në pozicionet e mëposhtme është saktësisht në të njëjtën kohë pa bërë supozime shtesë.Të dhënat e marra në këtë studim janë më në përputhje me (por nuk mund të vërtetojnë) se domeni NiRAN është i përfshirë në fillimin e sintezës së ARN-së të induktuar nga proteina.Më parë besohej se funksioni i domenit NiRAN në 5??Mbulimi ²-ARN ose reaksionet e lidhjes së ARN-së nuk ndikohen nga këto dhe Mbështetja e të dhënave të tjera.Prandaj, për shembull, vendi aktiv i NiRAN konsiderohet se përfshin Asp-në e konservuar si një bazë të përgjithshme (D252 në Pseudomonas syringae SelO; D4271 në HCoV-229E pp1ab; D208 në SARS-CoV-2 nsp12) (Shtojca SI, figura 2 ).S2) (17, 22, 33), ndërsa katalizimi në ligazën e ARN-së të varur nga ATP dhe enzimën mbuluese të ARN-së kryhet nga ndërmjetësi i enzimës kovalente-(lizil-N)-NMP, i cili përfshin një mbetje të Lys jo të Ndryshuar ( 41).Për më tepër, specifika e jashtëzakonshme e bazuar në sekuencë e koronavirusit NiRAN për objektivat e proteinave të konservuara dhe specifika e relaksuar për bashkë-substratet NTP (preferon UTP) kundërshton enzimën mbuluese të ndërmjetësuar nga NiRAN ose funksionet e ngjashme me ligazën e ARN-së.
Natyrisht, nevojitet shumë punë shtesë për të verifikuar dhe, nëse vërtetohet, për të elaboruar rolin e mundshëm të nsp9-UMP (nsp9-NMP) në sintezën e ARN-së të induktuar nga proteina, e cila do të lidhë disa raporte interesante, por (deri më tani) të raportuara më parë. .Vëzhgime të izoluara.Për shembull, është përcaktuar se fundi i ARN-së me fije negative të koronavirusit fillon me një fije oligo(U) (42, 43).Ky vëzhgim është në përputhje me idenë se sinteza e ARN-së me varg negativ fillon duke lidhur formën UMPylated të nsp9 me bishtin poli(A) (shkaktuesit), e cila mund të nxitet nga lidhja e saj me ARN-në. Aktiviteti dhe/ose ndërveprimi me një proteinë tjetër RTC.Pjesa UMP e siguruar nga nsp9 mund të përdoret më pas si një "primer" për oliguridilimin e ndërmjetësuar nga nsp7/8/nsp12, duke përdorur bishtin 3??²-poli(A) në ARN gjenomike ose një sekuencë tjetër që përmban oligo (A) shërben si një shabllon, i ngjashëm me mekanizmin e krijuar për proteinën VPg të pikornavirusit (44).Po sikur propozimi të jetë “jo-normativ”????Fillimi i sintezës së ARN-së të vargut negativ (të induktuar nga proteina) siguron një lidhje me vëzhgimet, duke treguar se ARN-ja e vargut negativ të koronavirusit ka UMP (në vend të UTP) në fund të saj (42), e cila konsiderohet të tregojë se acidi nukleik Dicer këput fundin e fosforiluar nga një endonukleazë e panjohur specifike për uridinën.Nëse konfirmohet, ky aktivitet hidrolitik i acidit nukleik mund të ndihmojë në çlirimin e formës oligomerike UMPylated të nsp9 nga fundi 5² i vargut negativ të sapolindur.Roli i mundshëm i nsp9 në përgatitjen e proteinave është gjithashtu në përputhje me studimet e mëparshme të gjenetikës së kundërt, të cilat kanë treguar se nsp9 (dhe nsp8) ndërveprojnë në mënyrë kritike dhe specifike me elementin e konservuar të ARN-së me veprim cis pranë skajit të tretë të gjenomit të koronavirusit.45).Sipas këtij raporti, këto vëzhgime të mëparshme tani mund të rishqyrtohen dhe zgjerohen përmes hulumtimeve të mëtejshme.
Në përmbledhje, të dhënat tona përcaktuan aktivitetin specifik të një etikete enzime të mbivendosur të virusit të lidhur me RdRp në terminalin N.Në koronavirus, ky aktivitet UMPylator/NMPylator i ndërmjetësuar nga NiRAN i sapo zbuluar përdoret për t'u mbështetur në Mn2+ dhe mbetjet ngjitur të Asn-it dhe për të shkaktuar formimin e lidhjeve fosforamidate (me energji të ulët) me aminën primare N-terminale.Nëpërmjet ndarjes së ndërmjetësuar nga Mpro në vendin e ndarjes nsp8|9, objektivi nsp9 mund të përdoret për NMPylation, duke treguar bashkimin funksional midis proteazës dhe domenit NiRAN, i cili shtrihet në RdRp.Ruajtja e mbetjeve kryesore në sitin aktiv nsp12 NiRAN dhe objektivi nsp9, i kombinuar me të dhënat e marra nga dy koronaviruse duke përfshirë SARS-CoV-2, ofron prova të forta se nsp9 NMPylation është një koronavirus. Karakteristikat konservative janë gjithashtu një hap kyç në riprodhimin e virusit.Të dhënat e disponueshme na bëjnë të konkludojmë se roli specifik i formës NMPylated të nsp9 në sintezën e ARN-së të induktuar nga proteina është një skenar i arsyeshëm për koronavirusin dhe viruset e tjerë të mbivendosur, dhe NiRAN mund të synojë gjithashtu proteina të tjera të paidentifikuara.Rregulloni virusin.Ndërveprimi i hostit.Nëse konfirmohet, përfshirja e primerëve të proteinave në sintezën e ARN-së virale do të rrisë afinitetin e sekuencës së domeneve Mpro/3CLpro dhe RdRp midis koronavirusit të zbuluar më parë dhe supergrupit të ngjashëm me pikornavirusin (9), të cilët tani janë unifikuar në Pisoniviritet e krijuara së fundmi. 46) në kategori.
Të dhënat tona tregojnë gjithashtu se aktivitetet enzimatike bazë, selektive dhe konservative të identifikuara në këtë studim mund të përdoren si objektiva për barnat antivirale.Komponimet që ndërhyjnë në lidhjen (dhe modifikimin e mëvonshëm) të terminalit nsp9 N të konservuar në zonën aktive të NiRAN mund të zhvillohen në barna antivirale efektive dhe të gjithanshme, të përshtatshme për trajtimin e koronaviruseve të kafshëve dhe njerëzve nga infeksione (nën) gjini të ndryshme. , duke përfshirë SARS-CoV-2 dhe Sindromën e frymëmarrjes të Lindjes së Mesme Coronavirus.
Sekuenca koduese e proteinës së koronavirusit të prodhuar në këtë studim u përforcua me RT-PCR duke përdorur ARN të izoluar nga Huh-7 i infektuar me HCoV-229E ose Vero E6 i infektuar me SARS-CoV-2 dhe u fut duke përdorur procedura standarde të klonimit.pMAL-c2 (New England Biological Laboratory) ose vektori i shprehjes pASK3-Ub-CHis6 (47) (Shtojca SI, Tabelat S1 dhe S2).Zëvendësimet e vetme të kodonit u prezantuan nga mutagjeneza e drejtuar nga vendi i bazuar në PCR (48).Për të prodhuar proteinën e shkrirjes MBP, qelizat E. coli TB1 u transformuan me konstruktin e duhur plazmid pMAL-c2 (shtojca SI, Tabela S1).Proteina e shkrirjes u pastrua me kromatografi me afinitet amilozë dhe u nda me faktorin Xa.Më pas, proteina e etiketuar me His6 të terminalit C u pastrua nga kromatografia e afinitetit të metalit të imobilizuar me Ni (Ni-IMAC) siç përshkruhet më parë (49).Për të prodhuar proteinën e shkrirjes së ubiquitinës, qelizat E. coli TB1 përdorën konstruktin plazmid të përshtatshëm pASK3-Ub-CHis6 (Shtojca SI, Tabelat S1 dhe S2) dhe ADN-në plazmidike pCGI që kodon hidrolazën C-terminale specifike të ubiquitinit 1 (Ubp1).Transformimi (47).Proteina e koronavirusit e etiketuar me C-terminal His6 u pastrua siç përshkruhet më parë (50).
Testi i vetë-NMPilimit i HCoV-229E nsp12-His6 u krye siç përshkruhet në EAV nsp9 (16).Shkurtimisht, nsp12-His6 (0,5 µM) përmban 50 mM 4-(2-hidroksietil)-1-piperazineethansulfonik acid (HEPES)-KOH, pH 8,0, 5 mM ditiothreitol (DTT), 6 mM MnCl2, 25 incubate bufer NTP e specifikuar dhe 0,17 µM përputhen me [α32-P]NTP (3,000 Ci/mmol; Hartmann Analytic) në 30 °C për 30 minuta.Në të gjitha analizat e tjera (standarde) të NMPilimit të nsp9 NMPilimit të ndërmjetësuar nga nsp12, kushtet e reagimit rregullohen si më poshtë: nsp12-His6 (0,05 μM) dhe nsp9-His6 (4 μM) në prani të 50 mM HEPES-KOH (pH 8,0 ), 5 mM DTT, 1 mM MnCl2, 25 μM treguan NTP dhe 0,17 μM të përputhur [α32-P]NTP.Pas inkubimit për 10 minuta në 30°C, kampioni i reaksionit u përzie me tampon mostër SDS-PAGE: 62,5 mM tris(hidroksimetil) aminometan HCl (pH 6,8), 100 mM DTT, 2,5% SDS, 10% glicerinë dhe 0,0005% blu.Proteina u denatyrua duke u ngrohur në 90 °C për 5 minuta dhe u nda me 12% SDS-PAGE.Xheli fiksohet dhe ngjyroset me tretësirë Coomassie Brilliant Blue (40% metanol, 10% acid acetik, 0,05% Coomassie Brilliant Blue R-250), dekolorizohet dhe ekspozohet në një ekran imazherie fosforeshente për 20 orë (për të zbuluar nsp12 nga NMPylation) ose (maksimumi) 2 orë (për të vlerësuar nsp9 NMPylation).Një imazher Typhoon 9200 (GE Healthcare) u përdor për të skanuar ekranin dhe ImageJ u përdor për të analizuar intensitetin e sinjalit.
Për analizën e MS, 1 μM nsp12-His6 dhe 10 μM nsp9 (pa etiketë heksahistidine) u përdorën në analizën e NMPilimit (shtojca SI, Tabela S1) dhe u përdor përqendrimi i rritur prej 500 μM UTP dhe GTP.Në varësi të përqendrimit të tyre dhe cilësisë së proteinave të pritshme, një sistem HPLC i Waters ACQUITY H-Class i pajisur me një kolonë MassPrep (Ujërat) u përdor për të shkrirë 1 deri në 10 µL të tretësirave të proteinave të buferuara në internet.Proteina e shkripëzuar elurohet në burimin e joneve elektrospërkatës të spektrometrit masiv Synapt G2Si (Ujërat) përmes gradientit vijues të tamponit A (ujë/0,05% acid formik) dhe tamponit B (acetonitril/0,045% acid formik), dhe temperatura e kolonës është 60 ° C dhe një shpejtësi rrjedhje prej 0,1 mL/min: elucioni në mënyrë isokratike me 5% A për 2 minuta, më pas një gradient linear në 95% B brenda 8 minutave dhe mbajeni 95% B për 4 minuta të tjera.
Zbulohen jone pozitivë me një gamë të masës prej 500 deri në 5000 m/z.Glu-fibrinopeptidi B matet çdo 45 sekonda për korrigjimin automatik të zhvendosjes së masës.Përdorni softuerin e instrumentit MassLynx me shtrirjen MaxEnt1 për të shkëputur spektrin mesatar pas zbritjes së vijës bazë dhe zbutjes.
UMPylated HCoV-229E nsp9 u tret duke shtuar tripsinën (Serva) të modifikuar sipas shkallës së sekuencës dhe u inkubua gjatë natës në 37 °C.Një kolonë rrotullimi Chromabond C18WP (numri i pjesës 730522; Macherey-Nagel) u përdor për të kripur dhe përqendruar peptidet.Më në fund, peptidi u shpërnda në 25 µL ujë, i cili përmbante 5% acetonitril dhe 0,1% acid formik.
Mostrat u analizuan nga MS duke përdorur një spektrometër masi Orbitrap Velos Pro (Thermo Scientific).Sistemi i fundit nanoâ HPLC (Dionex), i pajisur me një 50 cm të montuar me porosi në fund??Kolona 75 μm C18 RP e mbushur me rruaza magnetike 2,4 μm (Dr. Albin Maisch High Performance LC GmbH) Lidhu me spektrometrin e masës online nëpërmjet burimit të nanospray Proxeon;injektoni 6 µL tretësirë të tretjes së tripsinës në një diametër të brendshëm 300 µm ×??Kolona e parapërqendrimit 1 cm C18 PepMap (Thermo Scientific).Duke përdorur ujë/0,05% acid formik si tretës, kampioni u bllokua automatikisht dhe u shkripëzuar me një shpejtësi rrjedhjeje prej 6 µL/min.
Gradientët e mëposhtëm të ujit/0,05% acid formik (tretësi A) dhe 80% acetonitril/0,045% acid formik (tretësi B) u përdorën për të arritur ndarjen e peptideve triptike me një shpejtësi rrjedhjeje prej 300 nL/min: 4% B për 5 minuta, pastaj gradient linear 30 A në 45% B brenda minutave dhe një rritje lineare në 95% tretës B brenda 5 minutash.Lidheni kolonën kromatografike me një nano-emetues çeliku inoks (Proxeon) dhe spërkatni eluentin direkt në kapilarin e nxehtë të spektrometrit të masës duke përdorur një potencial prej 2,300 V. Skanimi i studimit me një rezolucion prej 60,000 në analizuesin e masës Orbitrap është i lidhur me të paktën tre skanime të të dhënave MS/MS, të përjashtuara në mënyrë dinamike për 30 sekonda, duke përdorur shkëputje lineare të shkaktuar nga përplasja e kurthit të joneve ose shkëputje të përplasjes me energji më të lartë të kombinuar me zbulimin e orbitrapit, Rezolucioni është 7500.
Koha e postimit: Gusht-03-2021